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體外培養-產生真正的人造卵母細胞
作者: 來源: 發布于:2016-10-25 14:05:37 點擊量:

小鼠卵細胞的前身是雌性原始生殖細胞(PGCs)。PGCs形成于胚胎發育的初期(約6.5天),經過一系列分裂形成卵母細胞,并在小鼠成年后在激素的調控下生成成熟的卵細胞。一直以來,利用多能干細胞誘導分化出具有活性的卵細胞是發育生物學研究的熱點之一。

2011年,京都大學Mitinori Saitou實驗室的同一研究小組成功地利用小鼠干細胞生成了功能性的精子。精子是身體的一些較簡單的細胞,而卵母細胞則復雜得多。

2012年京都大學Mitinori Saitou實驗室在Science發表了干細胞里程碑式研究成果:人造卵子,日本的研究人員成功地誘導小鼠干細胞成為了可生長發育的卵子,生成了健康的幼鼠。但是本研究中體外培養5天后,研究人員需要將這些PGCs原始生殖細胞移植入成年小鼠體內,只有這樣才能獲得卵母細胞。

 文獻下載鏈接:Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell–like Cells in Mice[J]. Science, 2012, 338(6109):971-5.【點擊下載】

最新的這項研究則是在2012年研究基礎上,進一步擴展了他們的培養技術,實現從整個胚胎干細胞到卵母細胞分化的過程,這個階段在體內大約需要30天時間。2016年7月,Hayashi團隊在實驗室實現了小鼠卵巢環境的重建,為原始生殖細胞的發育提供了支持,從而生成成熟、可育的卵細胞。

文獻下載鏈接:Hikabe O, Hamazaki N, Nagamatsu G, et al. Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line[J]. Nature. 2016 Oct 17. doi: 10.1038/nature20104.  【點擊下載】

   胚胎干細胞(ESCs)、誘導性多功能干細胞(iPSCs)培育卵細胞需要的步驟:

1. 誘導幾個基因生成PGC樣細胞(PGC-like),然后將其與雌性性腺體細胞混合,創造出了體外“重組卵巢”。這些細胞會逐漸失去PGC標志表達,開始表達卵母細胞標記。

2. 在培養基中生長了三周后,觀察到了減數分裂前期的初級卵母細胞,添加一種雌激素抑制劑,使早期階段的卵母細胞體外形成卵巢卵泡,再向培養基中加入促卵泡素和另外兩種因子,使卵母細胞繼續生長11天,組裝出生發泡卵母細胞。

3. 成熟培養基中的生發泡卵母細胞就會成為減數分裂-捕獲卵母細胞。

此研究進行了三次培養實驗,獲得了58個重組卵巢和3,198個生發泡卵母細胞,其中28.9%能成熟進入減數分裂II階段。檢測這些卵母細胞的質量,研究者對染色體分析發現其中78%的細胞有正確數量的染色體;又采用RNA測序方法,比對了體內卵母細胞和培養皿來源的卵母細胞的表達情況,結果424個基因出現了或高或低的表達變化,特別是線粒體功能的基因。

最后研究人員將這些卵母細胞與野生小鼠精子進行體外受精,共獲得300多個胚胎,將這些胚胎移植至代孕鼠子宮,只有11例胚胎完成發育,這一技術生育下一代的成功率遠遠低于成年小鼠;而且培養出健康的,能正常發育的小鼠相對于野生型小鼠體質弱一些。

本研究為理解卵子形成進程提供了新的藍圖,也為實現人體小鼠胚胎干細胞(ESCs)和誘導多能干細胞(iPSCs)轉化提供了技術鋪墊。



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